多穗金粟兰内生真菌分离、鉴定及其次生代谢产物的研究

【摘要】内生真菌(endophyticfungi)是指在其部分或全部生活史生活在植物的各种组织和器官细胞内或细胞间隙中,对宿主不表现明显病害的一类真菌。研究发现,内生真菌能够产生多种与宿主植物相同或相似以及结构新颖的活性物质。金粟兰属(Chloranthusswarts)植物是我国传统的药用植物,其化学成分具有抗肿瘤、抗菌、增强免疫等活性。全球共有15种,主要分布于亚洲东部和南部,其中我国约有13种5变种,且多分布于西南地区。到目前为止,有关金粟兰属植物的研究与开发还尚不深入,而且在国内外均未见到有关金粟兰属植物内生真菌研究的任何报道。基于此,本文以金粟兰属(Chloranthusswarts)植物多穗金粟兰(Chloranthusmultistachys)为研究对象,从其根、茎、叶3部分组织中共分离获得65株内生真菌,并对所分离的内生真菌进行了鉴定和抑菌活性筛选,优选出两株具有较高抑菌活性的菌株CL39和CL61,且进一步对其次生代谢产物进行化学成分分离与鉴定。主要研究结果如下：1.较为系统地研究了多穗金栗兰内生真菌的分布特点。采用组织分离法和3种分离培养基,从多穗金粟兰的根、茎、叶3部分组织中共分离纯化得到65株内生真菌。从分布来看,不同部位分离到的内生真菌数量不同,茎中分离得到的内生真菌有29株,占总数的45%；叶和根次之,分别有27和9株,占总数的42%和14%。根据形态学和分子生物学方法鉴定表明,65株内生真菌分属于2个亚门、3个纲、6个目、6个科、10个属,分别为镰孢霉属(Fusariumsp.)、头孢霉属(Cephalosporiumsp.)、粘帚霉属(Gliocladiumsp.)、暗双孢属(Cordanasp.)、丝核菌属(Rhizoctoniasp.)、盘色多隔霉属(Coryneumsp.)、刺盘孢属(Colletotrichumsp.)、拟茎点霉属(Phomopsissp.)、拟隐孢壳属(Cryptosporiopsissp.)、拟盘多毛菌属(Pestalotiopsissp.).其中,镰孢霉属(Fusariumsp.)、头孢霉属(Cephalosporiumsp.)、盘色多隔霉属(Coryneumsp.)为优势种群,分别占菌株总数的15.4%、13.8%、13.8%。由此可知,多穗金粟兰内生真菌在数量、分布和种群等方面都存在差异,具有较为丰富的物种多样性。2.采用抑制菌丝生长率法测定了65株内生真菌发酵滤液对苹果炭疽病菌等7种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用。活性测试结果显示,在离体条件下,至少对一种植物病原真菌生长抑制率在75%以上的活性菌株有43株,占总菌株数的66.2%；至少对3种病原菌抑制作用达30%以上的有39株,约占总数的60%；对7种病原菌抑制作用均达到30%以上的有9株,约占总数的13.8%。其中菌株CL39、CL61的发酵液7种病原菌抑菌率均在75%以上,具有较高的抑制活性。以上结果表明,多穗金粟兰内生真菌具有广谱的抑菌活性。3.根据真菌的形态学和分子生物学鉴定结果,CL39菌株为镰刀菌属(Fusariumsp.)真菌,CL61菌株为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.)真菌。根据之前对这两属真菌的研究可知,镰刀菌属和拟盘多毛孢属均为活性菌株,其代谢产物多具有抗癌、杀菌等活性,值得进一步研究。4.对活性菌株CL39和CL61进行液体发酵,并对其次生代谢产物进行分离、纯化。经反复硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析、薄层制备层析等各种色谱技术分离纯化,共分离得到6个化合物,综合运用’H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、DEPT、HMBC、HMQC等波谱技术,并与相关文献对比,鉴定了这6个化合物的结构,分别为：化合物CL391和CL392,环桉烯醇,(-)(7S,8R)-dihydrodehydrodiconiferyalcohol、12R,15-dihydroxylabda-8(17),13E-dien-19-oicacid和β-ecdysterone.其中,化合物CL391和CL392是两个结构新颖的多羟基甾醇化合物。上述结果表明,多穗金粟兰蕴藏着较为丰富的内生真菌且具有良好的抗菌活性,是潜在的天然药物资源。
【作者】王安然；
【导师】董锦艳；
【作者基本信息】西南大学，微生物，2014，硕士
【关键词】多穗金粟兰内生真菌；分离鉴定；抑菌活性；次生代谢产物；

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